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ABTS清除能力试剂盒

产品编号:4188200
规格:微板法
包装规格:96样
产品类别:其他试剂盒
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4188200微板法96样询价2-5天

ABTS是一种介体物质,用 K2S2O8与 ABTS直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+,抗氧化物质与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色。

ABTS+·自由基离子的最大吸收波长为 734nm,所以,用 A734  nm可以检测 ABTS+·自由基离子的浓度。如果 A734nm减小,表明 ABTS+·自由基离子被清除,进而对样本中 ABTS清除能力进行定量分析。

试剂盒的组成和配制:

试剂名称

规格

保存要求

备注

试剂一

粉剂 mg×2支

4℃保存

用前甩几下使粉剂落入底部 ,每支加0.49mL蒸馏水溶解(溶解后一周内用完)。

试剂二

粉剂 mg×1支

4℃保存

临用前甩几下使粉剂落入底部 ,再加2.86mL蒸馏水,充分溶解备用。

标准品

粉剂 mg×1支

4℃保存

若重新做标曲,则用到该试剂。

工作液配置:临用前将加水溶解后的试剂一和试剂二按照 1:1比例混合,避光反应 12h后(二天内用完),再用无水乙醇稀释 20-30倍备用(使 A空白管在 0.7±0.1,用乙醇稀释后的液体即工作液最好现配现用)。

所需的仪器和用品:

酶标仪、96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。

ABTS自由基清除能力测定:

建议正式实验前选取 2个样本做预测定,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、样本制备:

①组织样本:

称取约 0.1g新鲜组织或者称取约 0.05g烘干样本(将样本在 105℃下杀青 3min,然后60℃烘干至恒重,粉碎,过 40目筛,得到烘干样本),加入 1mL的 80%甲醇提取液(若鲜样需研磨均质),于 60℃,200-300W条件下超声提取 30min(间隔 5min振荡混匀一次),若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm室温离心 10min,取上清测定。

【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例进行提取。

②细菌/细胞样本:

先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500万细菌或细胞加入 1mL的 80%甲醇提取液进行匀浆;匀浆后转入  2mL离心管中;于 60℃,200-300W条件下超声提取 30min(间隔 5min振荡混匀一次),若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm,离心 10min,取上清置冰上待测。

【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104个):提取液(mL)为 1000~5000: 1比例进行提取。

③液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。

2、上机检测:

①酶标仪预热 30min以上,调节波长至 734nm。

②不同样本清除能力不一,可先选取 2个样本做检测,若 A测定-A对照接近零,需对样本进行稀释(用 80%甲醇提取液稀释)后再检测,稀释倍数 D代入公式计算。

③在 96孔板中依次加入:

试剂名称(μL)测定管对照管空白管
样本1010
无水乙醇
19010
工作液190
190
混匀,室温(25℃)避光静置  6min,于 734nm处读取吸光值 A。

【注】若一次性样本较多,可用排枪或者分批检测,以使测定管的反应时间(避光静置 6min)保持一致。

结果计算:

1、标准曲线:y = 0.5042x - 1.4213,x是标准品 Trolox质量(μg/mL),y是清除率(%)。

2、ABTS自由基清除率(%)=[(1-(A测定-A对照)÷A空白)×100]%

3、定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的ABTS自由基清除能力。

4、按样本质量计算:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷W×D

举例:若清除率是 70%,则用 70代入公式计算,即:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D

5、按细菌或细胞数量计算:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷500×D

举例:若清除率是 70%,则用 70代入公式计算,即:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D

6、液体样本:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(清除率+1.4213)÷0.5042]×D=1.983×(清除率+1.4213)×D

举例:若清除率是 70%,则用 70代入公式计算,即:

ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(70+1.4213)÷0.5042]×D

V---加入提取液体积,1 mL;

V1---反应中样品体积,10μL=0.01 mL;

W---样品质量,g;

500---细菌或细胞总数,万;

Trolox分子量---250.29;

D---稀释倍数,未稀释即为 1;

附:标准曲线制作过程:

1制备标准品母液(1mg/mL):称取 2mg标准品即 Trolox至一新 EP管,再加 2mL甲醇充分溶解,即 1mg/mL标准品,备用。

2把母液用甲醇稀释成以下浓度梯度的标准品:0,20,40,60,80,100μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3按照测定管加样体系操作,依据结果即可制作标准曲线。

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